成都先导与强生合作共同开发出基于胆固醇修饰的DNA内标的DEL化学反应监测方法 发布时间：2021-03-09

近日，成都先导药物开发股份有限公司（以下简称“成都先导”）与强生合作，针对DNA编码化合物（DEL）合成过程中混合样化学反应难以监测的问题，开发出了基于胆固醇修饰的DNA内标的DEL化学反应监测方法。该方法操作方便，可以有效的监测到混合的DEL样品中各种常规化学反应的转化情况，为DEL的生产放大操作提供相应的参考。该结果目前发表于期刊《Bioconjugate Chemistry》。

图1 研究结果文章发表

1. DEL反应有效性评估受限，引入内标可有效解决该问题

DNA编码化合物库（DEL）合成的核心策略被称为”split and pool”。通过这个策略，可以在极短时间内构建包含数百万甚至数千万分子的化合物库。但这个策略会带来一个挑战，就是如何在库合成过程中，对一个包含数百个乃至数十万个分子的混合体系进行化学反应的监测，确保反应能按预期进行。常规思路主要是检测反应前后混合物平均分子量的变化，通过平均分子量的迁移判断反应的进行。但这个方法受限于混合物体系的复杂性，很难得到准确的结论。

在DEL合成操作过程中引入一个内标可以有效的解决前面提到的问题。而这个内标需要具备以下几个性质：

1）与DNA底物的结构相类似；

2）在LC上与DEL样品具有良好的分离度，便于解析mass数据；

3）反应转化率与验证体系的产率一致；

4）在混合样的复杂体系中能保持相应的转化率。

2.  通过HPLC可实现内标与常规DEL样品良好分离

成都先导团队与强生团队合作，在进行充分的文献调研后，设计并合成了单链与双链胆固醇修饰的内标4和5。首先通过与常规的DEL验证底物6进行HPLC比较，证明了胆固醇修饰后的样品确实与常规DEL样品可以在LC上实现良好的分离（图2）。

图2 胆固醇修饰的DNA内标4和5代表结构及其与headpiece 6的HPLC谱图比较

3. 内标与常规DEL样品反应活性近似，可用于DEL化学反应效率监测

接下来，我们对内标4和5的反应活性进行了验证。在不同场景下（单独内标4，单独内标5，单独headpiece 6，内标4混合实际DEL样品，内标5混合实际DEL样品）测试对比了内标针对五个常见于DEL合成的不同的反应的产率（缩合，还原胺化，SNAr，Suzuki与C-N coupling）。测试结果（图3）表明，无论是单样还是与DEL样品的混合物，内标的反应活性都与headpiece 6近似。前面的实验结果证明，胆固醇修饰的DNA内标确实可以用于DEL pool样品的化学反应监测。

图3 胆固醇修饰的DNA内标反应活性测试结果 （A-内标4单样，B-内标5单样，C-headpiece，D-内标4混合库样品，E-内标5混合库样品）

4. 内标引入有利于增加DEL 反应官能团多样性

成都先导团队针对DEL库合成的实际操作，建立了一套完整的DNA内标的使用流程。常规的DEL库合成是在96孔板中进行。在使用胆固醇修饰的DNA内标时，H11与H12号孔作为内标孔，不参与反应后的pooling。其中一个孔加入内标与DEL中间体的1:1混合物，另一个孔只加入内标。一个随机挑选的BB加到两个内标空里进行反应（图4）。在整板反应结束后，对两个内标孔进行LCMS检测。当两个内标的反应产率与验证产率一致时，我们就可以认为反应是成功的。当尝试在DEL合成中构建氨基甲酸酯时，就成功通过胆固醇修饰的DNA内标发现反应无法在进行完ligation后样品上进行。通过对原料进行HPLC纯化并调整反应顺序（先做化学反应再做ligation），成功把氨基甲酸酯引入到DEL合成中。

图4 胆固醇标记的DNA内标实际使用方法

综上，成都先导团队与强生团队成功开发了基于胆固醇修饰的DNA内标的DEL库合成的化学反应监测方法。该方法创造性的把胆固醇修饰的DNA应用到DEL合成的化学反应监测之中。与传统的通过检测混合物平均分子量迁移的方法相比，新的方法能更准确的判断DEL中间体混合体系中化学反应的进行情况，为DEL合成提供更准确的质量控制数据，从而提高DEL的合成质量并提高DEL筛选与先导化合物确定的成功率。

参考文献：

Guanyu Yang, Dou He, Yijun Zhu, Weiwei Zhu, Yang Tan, Xingwen Long, Jinqiao Wan, Zhicai Shi, David Schuman, Pratik Chheda, Nicholas Simmons, and Guansai Liu Cholesterol-Modified Oligonucleotides as Internal Reaction Controls during DNA-Encoded Chemical Library Synthesis; Bioconjugate Chemistry; Article ASAP; DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.1c00045