先导科普荟 | 体外渗透性评价：加速药物早期研发，提高成药属性 发布时间：2022-07-20

口服是首选的给药途径，口服药物需要通过胃肠道充分吸收、经过肝脏首过代谢后到达血液循环，才能确保其抵达预定靶点并发挥治疗效果。药物的溶解度和渗透性是影响其吸收的重要因素，并被广泛用于指导新药研发^[1]。

1．渗透性的基本原理

药物渗透性是指药物分子通过某个生物膜屏障的速度，它是药物被小肠吸收、通过血液-器官屏障、通透进入细胞以及肝和肾清除的必要过程，也是影响药物通过肠道吸收和口服生物利用度的决定因素之一。由于药物的细胞膜渗透性对于药物发挥疗效起着关键作用，其活性、毒性以及其他生理过程都取决于其膜渗透性，因此化合物的渗透性是药物早期研发阶段需要关注的重要指标。

药物在肠道中的吸收机制可分为通过细胞旁路的被动扩散、跨细胞膜的被动转运、活性转运体介导的主动转运、胞吞作用以及外排（如图1）^[2]。

图1：肠道吸收模式和机制

（1）细胞旁路扩散；（2）被动转运；（3）主动转运；（4）胞吞作用；（5）外排

化合物的通透性受多种因素影响，主要包括：所在组织部位、药物浓度梯度、跨膜pH差别、转运体表达量、转运体的K_m值、细胞两侧的转运体分布（即顶侧或基底侧）、化合物对各种转运体的亲和力，以及形成膜屏障的细胞间孔隙的大小。各种渗透性机制会根据上述条件发生动态调整。以药物浓度为例，当高浓度的药物在胃肠道中使转运体达到饱和，高浓度梯度驱动被动扩散，因此被动扩散成为药物吸收的主要途径。相反，在血脑屏障处，循环系统中的药物浓度要低得多，通常达不到使转运体饱和的程度。在此情况下，若药物是转运体的底物，主动转运机制将对总渗透性产生较大的影响。

2. 渗透性评价模型

目前，各国法规中推荐的不涉及人体受试者的用于预测药物肠道渗透性的模型主要包括：动物模型的体内或原位肠道灌注模型、离体的人或动物肠道组织模型，以及单层人工培养上皮细胞模型^[3-5]。原位模型比离体模型和人工培养的细胞模型更接近机体内的情况，但成本更高，且不同动物组间存在一定差异。离体组织的离体培养时间有限，实验需要快速完成，取样点较少，因此该模型多用于初步定性研究^[6]。人工培养的单层细胞模型主要是人结肠癌来源的Caco-2细胞和马丁达比犬肾上皮细胞演变得到的MDCK细胞。此外，Kansy等^[6]于1998年提出了平行人工膜渗透模型（parallel artificial membrane permeability assay, PAMPA），以人工磷脂作为生物膜来模拟药物跨膜的屏障，用于测定药物的被动跨膜渗透。三种体外检测模型也各具优势和局限性。

Caco-2模型

Caco-2细胞是一种人类结肠腺癌细胞。经过培养，Caco-2细胞单层分化出绒毛面顶侧和基底面基底侧，表现出细胞极性，且具有明确界定的顶端刷状缘和紧密的细胞间连接以及小肠中的活性转运体，形态学上类似小肠吸收细胞。由于采用Caco-2细胞单层测定药物渗透性的方法较简单且重复性好，已被广泛用于评估药物在人体肠道的渗透吸收（图2）^[7-8]。

Caco-2细胞接种于半透膜（如聚碳酸酯多孔膜）上经过21-29天的培养后细胞生长分化为完整的细胞单层，可通过验证细胞形态学以及测定跨膜电阻（Transepithelial electrical resistance，TEER）、碱性磷酸酶活性、标志物（如荧光黄、苯酚红、甘露醇等）被动扩散跨膜通量测定等方法考察Caco-2细胞单层的完整性。将待测化合物加入顶侧（Apical side，AP）和基底侧（Basolateral side, BL）孵育一定时间后检测两侧的化合物浓度，可通过计算表观渗透系数（apparent permeability, P_app）评估化合物的渗透性。P_app的计算公式为P_app (cm/s) = (dQ/dt) ×1/(A×C0), 其中：dQ/dt为渗透速率（μg/min），C0为被测药物的初始浓度（μg/mL）, A为单层细胞的表面积（cm²）。一般认为，P_app<1×10⁻⁶ cm/s为吸收不良的药物，人体吸收率在0%~20%；P_app在1×10⁻⁶ cm/s~10×10⁻⁶ cm/s为吸收中等的药物，吸收率在20%~70%；P_app>10×10⁻⁶ cm/s为吸收良好的药物，吸收率在70%~100%。研究表明，口服药物的Caco-2渗透系数与人体肠道吸收比率（FA%）具有较好的相关性（如图2所示），因此Caco-2模型常被公认为体外研究和预测化合物肠道渗透和吸收的“金标准”方法，并且其应用不再局限于被动转运，已逐步扩展至主动转运以及转运蛋白介导的药物相互作用研究。

Caco-2细胞模型尚存在一定不足：该模型本身为单一细胞构成（细胞系），缺少细胞异质性；转运蛋白、代谢酶、核受体的表达与小肠细胞相比存在差异；缺乏在小肠上皮细胞中的黏液层；细胞培养时间过长（21天）；细胞间紧密连接过紧；缺少细胞培养标准以及试验操作标准，造成不同实验室间的结果有时缺乏可比性等。

图2：Caco-2细胞模型，P_app值与人小肠吸收比率（FA%）的相关性

MDCK模型

马丁达比犬肾（Madin Darby Canine Kidney，MDCK）上皮细胞由马丁和达比两人而得名，他们于1958年从一只正常的成年雌性可卡犬中分离和建立了该细胞系^[9-10]。MDCK细胞是在遗传学背景以及细胞的脂质、蛋白质组成方面最为理想的上皮细胞系，早期主要用于研究上皮细胞的发育和功能 ^[11]。

MDCK细胞与Caco-2细胞具有许多相同的上皮细胞特征，也有类似的吸收和外排转运体（如表1所示^[12-13]），且只要短短3天即可分化成柱状上皮并形成紧密细胞连接。研究表明，被动吸收的药物在MDCK模型和Caco-2模型上的渗透性数据有很好的相关性（如图3^[14]所示），而且两个模型测得的渗透性数据与其人体吸收比率的相关性都比较接近（Spearman相关性系数r分别为0.58^[14]和0.54^[14]），因此，MDCK模型也逐渐成为研究和预测药物肠道吸收渗透的替代模型。MDCK细胞许多生理特性与血脑屏障（Blood-brain barrier, BBB）相似，也常用于体外药物透过BBB的筛选（如图4所示）^[15]。

MDCK模型的局限性：首先，MDCK细胞并非来源与肠道细胞，其转运蛋白表达类型和水平与肠道细胞有差异；其次，MDCK细胞不是人源细胞，无人源转运蛋白表达，在评估主动转运的药物时，内源性的犬类转运蛋白表达（特别是犬MDR1）可能对数据的解读产生干扰。因此，通常需要在MDCK细胞中稳定表达人源转运蛋白基因构建成过表达细胞系（如构建人P-gp转运体基因MDR1的MDCK-MDR1细胞系），通过计算MDCK-MDR1以及MDCK细胞系的净外排比（Net ER=ER_MDCK-MDR1/ER_MDCK）等方法尽量排除内源性犬类转运蛋白对结果的影响，更准确地研究药物的主动转运机制，特别是药物与人源转运蛋白P-gp的相互作用特征。

表 1：Caco-2细胞和MDCK细胞的特征

图3：MDCK细胞模型P_app值与Caco-2细胞模型P_app值的相关性

图4：不同CNS渗透类型化合物在MDCK细胞模型P_app值

PAMPA模型

平行人工膜渗透（parallel artificial membrane permeability assay，PAMPA）模型由Kansy等^[6]优化建立，用于模拟口服药物在胃肠道中的被动扩散吸收状态。

该模型的工作原理是：将含有卵磷脂的有机溶剂涂布在96孔的聚偏氟乙烯或聚碳酸脂膜上，卵磷脂在小孔孔隙中心形成非常稳定的薄膜。将pH7.4或pH6.5缓冲液注入形成了人工磷脂膜的96孔中，将其置入含有化合物样本缓冲液的96孔板中使得磷脂膜接触到化合物溶液，如此形成“三明治”结构：底部是待测物的供体缓冲液，中间是人工磷脂膜，待测化合物分子从下层供体缓冲液中扩散穿过人工磷脂膜，进入到上层受体缓冲液中。待扩散完毕后可用紫外分光光度计或者LC/MC测定受体缓冲液和供体缓冲液中的化合物浓度，并计算出有效透过率P_e (cm/s)。P_e=-ln[1-(C_A(t)/C_equilibrium)]/[A×(1/V_D+1/V_A)×t]，C_equilibrium=[C_D(t)×V_D+C_A(t)×V_A]/(V_D+V_A)，其中A表示人工磷脂膜的面积（cm²），V_D表示供体孔缓冲液的体积（mL）, V_A表示接收孔缓冲液的体积（mL）, t表示渗透时间（s）, C_A(t)表示在t时间点受体缓冲液的浓度，C_D(t) 表示在t时间点供体缓冲液的浓度。

PAMPA模型的局限性：由于PAMPA模型使用的是人工磷脂膜，不具备转运蛋白，所以PAMPA模型仅适用于被动扩散机制的药物而不能准确预测通过主动转运机制的药物；对于亲脂性的小分子化合物，无法通过PAMPA模型说明其是由细胞旁路渗透途径还是被动扩散途径穿过细胞膜。由于低分子量（MW<250）的极性分子主要通过细胞旁路扩散机制进行吸收，所以PAMPA模型也无法准确预测这类型分子的吸收状态。此外，滤板的孔隙率、缓冲液的pH和被测药物的解离度及脂溶性大小、扩散的时间等因素也会影响PAMPA对药物膜渗透率的测定。随着PAMPA技术的发展，通过对磷脂种类和比例、缓冲液pH值、处理浓度和时间等条件的优化，目前已形成了针对不同组织的药物渗透模型，可以有效地预测药物在各类型组织中的渗透性，如针对肠道吸收的PAMPA-DS（double sink）模型、针对脑部摄取的PAMPA-BBB模型、针对皮肤吸收的PAMPA-Skin模型等^[16]。PAMPA模型与Caco-2细胞、MDCK细胞模型联用，可避免独立模型的局限性，从而更准确地预测药物在体内的渗透和吸收特性。

3. 成都先导体外ADME评价体系

成都先导建立了一套完整的体外ADME和体内PK/PD检测平台体系，已广泛应用于客户和内部管线新药项目研发过程中的候选化合物优选。

在化合物体外渗透性检测模型方面，成都先导已经建立了稳定的Caco-2、MDCK和MDCK-MDR1渗透模型（结果示例如图5所示），可快速用于评估化合物的渗透性和渗透机制。

图5：Caco-2模型、MDCK-MDR1模型检测不同渗透性参考化合物的P_app值、Efflux Ratio值。

参考文献：

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[16]吴一凡, 刘晖, 倪京满. 平行人工膜渗透模型及其应用进展[J]. 药学学报, 2011, 46(8):6.