科技前沿 | DEL技术新应用：可用于片段筛选的PAC-FragmentDEL 发布时间：2022-08-31

近日，成都先导药物开发股份有限公司联合其英国子公司Vernalis在DEL筛选技术和FBDD筛选技术领域研究中取得重要进展，通过引入光反应基团，DNA编码的片段化合物库能够在靶点筛选中有效地筛选出小分子片段。目前该成果发表于RSC Medicinal Chemistry（图1，open access，文章地址：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/md/d2md00197g）。

图1：成果发表文章

片段筛选技术是当今主流的药物发现技术之一，使用该技术能够筛选得到一定数量与靶点活性口袋结合、便于改造的小分子片段，是先导化合物非常好的起点。迄今，全球已有6款FBDD技术衍生的药物获得了上市批准。但片段分子与靶点的作用力通常较弱（微摩尔-毫摩尔），因此FBDD技术发展的一个重要基础就是高灵敏度检测方法的应用。目前主流的检测方法有表面等离子共振技术（SPR）、基于配体发现或蛋白发现的核磁共振技术（LO-NMR or PO-NMR）、热转移分析（TSA）、X-晶体衍射（X-ray）以及质谱分析（MS）。这些检测技术加速了FBDD技术的发展，但也面临诸多挑战，如筛选片段的数量限制、靶蛋白的用量等。成都先导研究团队通过技术调研，结合自身DEL技术优势，设计了可用于片段筛选的PAC-FragmentDEL，能够有效解决上述问题。

图2：PAC-FragmentDEL设计

片段化合物库的设计与合成

PAC-FragmentDEL主要由三部分组成：DNA编码系统、linker和片段化合物。其结构如图2所示。其中，DNA编码系统用于编码引入的化合物，包括linker和片段化合物；Linker包含光交联双吖丙啶基团，以及用于调节双吖丙啶基团与片段分子之间距离的连接子；片段化合物则选自DNA反应兼容且基本符合三规则（Ro3）的分子砌块。在此原则下，作者优先选择建立了如下两类4个化合物库，其中Type 1化合物库第一维为调节双吖丙啶和片段分子距离的连接子，第二维为7417个片段化合物；Type 2化合物库为两个维度试剂组合的31982个片段化合物集合（图3）。

图3：片段化合物库

片段化合物库筛选

文章选取PAK4和2-epimerase两个靶点作为实验对象。其中PAK4为传统的丝氨酸/苏氨酸激酶，用于筛选的阳性控制，2-epimerase为二磷酸尿核苷-N-乙酰葡萄胺差向异构体酶，目前没有报导的小分子抑制剂，是具有挑战性的靶点。

首先，文章使用工具化合物（Kd分别为510 uM和300 uM）合成PAC-FragmentDEL conjugates进行PAK4靶点的筛选验证，对比实验结果说明与靶点有亲和力的片段分子能够在设定的筛选流程中富集（图4和图5）。进一步地，文章使用上述四个化合物库对PAK4和2-epimerase两个靶点进行筛选，结果显示301个片段化合物在PAK4筛选信号上富集，21个片段化合物在2-epimerase筛选信号上富集。如此，成功对两个靶点都筛选出一定数量的具有潜在活性的片段分子。

图4：PAC-FragmentDEL在PAK4靶点上的概念验证结果

图5：PAC-FragmentDEL筛选流程（+/-分别表示使用和不使用）

片段化合物验证

为验证筛选结果的可靠性，文章根据信号富集强度和结构多样性挑选11个PAK4靶点化合物和9个2-epimerase靶点化合物进行off-DNA片段合成，并使用LO-NMR和X晶体衍射对这些化合物进行检测验证。结果显示，LO-NMR检测下所有的片段化合物均与靶点结合，其中15个化合物能够顺利得到与靶点的共晶结构（图6）。X晶体衍射研究表明，化合物5、6和7结合在PAK4靶点的ATP结合域，均是未见报导的PAK4靶点的新颖化合物。化合物8和9结合在2-epimerase靶点的UDP辅因子位点，使酶处于打开、失活状体。值得说明的是，化合物5和8来自Type 1化合物库，化合物6和9来自于Type 2化合物库，化合物7在两个类型的化合物库中都出现富集。

图6：部分片段化合物及其靶点共晶结构（5、6和7为PAK4片段化合物，8和9为2-epimerase片段化合物）

结语

综上，成都先导成功发展了一种可用于片段筛选的DNA编码化合物库以及行之有效的筛选方法。与传统小分子片段筛选相比，它具有独特的优势：

（1）筛选蛋白用量少（250 pmol per sample），非常适用于一些蛋白表征或纯化困难的靶点；

（2）筛选速度快。从化合物库筛选到完成片段分析仅需2-3周的时间；

（3）化学空间广。PAC-FragmentDEL将片段连接到DNA上能够将更多因溶解度问题不能应用于传统筛选的片段分子引入至化合物库中，提升可筛选的化学空间。

基于上述研究和片段挑选原则，成都先导已完成3类、片段分子大于30K、总化合物数超140K的片段化合物库的建立，能够助力客户发现基于传统或新型靶点的早期工具化合物和苗头化合物。

了解更多片段筛选产品及服务信息，欢迎访问：https://www.hitgen.com/services.html. 

参考文献：

1.Huiyong Ma, James B. Murray, Huadong Luo, Xuemin Cheng, Qiuxia Chen, Chao Song, Cong Duan, Ping Tan, Lifang Zhang, Jian Liu, Barry A. Morgan, Jin Li, Jinqiao Wan, Lisa M. Baker, William Finnie, Lucie Guetzoyan, Richard Harris, Nicole Hendrickson, Natalia Matassova, Heather Simmonite, Julia Smith, Roderick E. Hubbard, Guansai Liu. PAC-FragmentDEL – Photoactivated Covalent Capture of DNA-Encoded Fragments for Hit Discovery, RSC Med. Chem., 2022, Advance Article

2.Nikolaj S. Troelsen, and Mads H. Clausen. Library Design Strategies to Accelerate Fragment-Based Drug Discovery. Chemistry - A European Journal, 2020, vol. 26, # 50, p. 11391 - 11403

3.James Osborne, Stanislava Panova, Magdalini Rapti, Tatsuya Urushima and Harren Jhoti.  Fragments: where are we now? Biochemical Society Transactions (2020) 48 271–280.

4.Joe Coyle and Reto Walser. Applied Biophysical Methods in Fragment-Based Drug Discovery. SLAS Discovery, Volume 25, Issue 5, June 2020, Pages 471-490