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  2. DNA编码化合物库筛选

DNA编码化合物库筛选

DNA编码化合物库(DEL)筛选是一个亲和筛选过程,与传统方法相比,DEL筛选具有许多优点:1)可以筛选数以千亿甚至万亿计的库化合物;2)大大节省蛋白质/靶标的使用量;3)筛选周期和化合物验证周期短;4)筛选成本更加低廉。


DNA编码化合物库筛选基本原理和如何发现功能性分子

DEL筛选使用非常高的靶标浓度(μM范围)来驱动平衡向靶标-化合物复合体的形成(筛选结果中直接读取的是靶标-化合物复合物的丰度),因此,在高靶标浓度的情况下,所需的化合物浓度可以变得非常低(每种化合物筛选前为10^5或更低的拷贝),在一个筛选板孔的数百微升体积内可以实现数千亿到数万亿的化合物筛选。

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由于DEL筛选的高效性,它允许同时筛选多个样本,通过多个样本(含有或不含参考化合物,不同形式的靶标等)的比较,从而判断化合物的结合位点,这样具有功能的化合物就容易被识别出来。请参考我们的案例分析了解详细信息。


DEL筛选对靶标的要求(主要参数)

对于纯化蛋白:

  • 纯度>90%; 需要说明蛋白有没有多聚体形式

  • 蛋白需要带有以下标签His, biotin, Strep, GST, FLAG and Fc (前三个为首选)

  • 蛋白标签不能影响蛋白的功能

  • 蛋白的用量视蛋白分子量而定(对于50KD的蛋白,6组样本的蛋白使用量约为1 mg)

对于细胞表面或细胞内靶标,请参考以下文献中的要求:ACS Comb Sci. 2015 Dec 14;17(12):722-31;  J Am Chem Soc. 2019 Oct 30;141(43):17057-17061;  Nat Chem. 2021 Jan;13(1):77-88. 


如何针对多个DNA编码化合物库进行筛选

在成都先导,我们按照化合物库分子类型、结构特征、化合物构建方式等进行分类混合,形成DNA编码化合物库的子集,然后对化合物库子集进行筛选,从而实现筛选的高效性和灵活性。我们也提供更为灵活的、基于筛选策略的聚焦化合物库子集或单库筛选,以提供有价值的结构-活性信息。


DEL筛选与先导化合物发现流程

  • 靶标活性确认与筛选条件研究

筛选条件研究包括对靶标活性的确认和筛选可行性的详细评估,以确保DEL筛选成功进行,尽量减少假阳性发生的机会。在筛选条件可行性评估中,我们针对试验中的缓冲液、ssDNA、去垢剂、参考化合物、靶标固定等进行详细的考察,以保证靶标能够重现其应有或类似的表现。这些仔细研究是为我们后续的筛选提供对靶标的了解和增加筛选中的过程把控。筛选条件实验室筛选非常重要的环节,针对复杂情况的处理是建立在大量筛选实验的基础上的。

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  • DEL筛选流程

根据DEL的不同筛选流程各有差异,以下为经典多样性化合物库的筛选流程,特殊DEL的筛选请参照:共价DEL筛选流程、蛋白降解DEL筛选流程、分子片段DEL筛选流程。

如下图所示,经典DEL筛选过程包括:1)靶标与化合物库的孵育,2)通过靶标标签固定靶标,3)洗脱未结合或结合弱的化合物,4)从靶标上解离富集的化合物,5)质检化合物库的回收率,6)重复1-5步(根据化合物库的回收率决定重复的轮次),7)当化合物库的富集倍数约等于10^8时,进入PCR扩增环节,8)DNA高通量测序,9)DNA序列分析,产生3维的化合物富集信息,10)根据化合物富集情况,选定需要重新合成的不含DNA标签的化合物,11)验证重新合成的小分子化合物,最终得到先导化合物。

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在成都先导,DEL筛选是在KingFisher系统下半自动完成的,以保证筛选样本之间的一致性、转移蛋白是最小的死体积和过程的可追溯性。有关KingFisher上的DEL自动化筛选,请参考以下的文献:Nat Protoc. 2016 Apr;11(4):764-80。


  • DEL筛选中库化合物的使用量

DEL筛选中库化合物的使用量指每一个化合物在首轮筛选中的拷贝数。我们系统性地对DEL化合物的使用量做了研究,请参考我们的文章:SLAS Discov. 2020 Jun;25(5):523-529。


  • PCR 和DNA 高通量测序

我公司的高通量测序主要使用Illumina测序平台,目前拥有Hiseq2500 和 NovaSeq6000两套测序仪。该测序平台提供6中不同的测序通量,提供从115M到6400M reads的稳定高质量测序(Q30≥90%),以适应不同筛选样本组合下的及时DNA测序(从筛选到测序再到数据分析的零时延)。我们对Illumina测序中的PCR方法进行优化,请参考我公司的专利(专利号201811151077.3)。

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DNA测序结果解析

测序数据解析是将筛选的结果以DNA序列的形式转换为这些DNA标签编码的化合物的过程,其中包括所使用的分子骨架、反应砌块和库化学反应。PolyO是HitGen发明的专有苗头化合物识别算法,是一种从高通量测序数据中识别富集特征(富集特征是指一组共享共同支架和/或构建块的化合物,通常用立方视图中的线表示)的灵敏方法。通过比较样本进行分析,在根据化合物的不同作用机制,将其在Data Warrior文件中生成化合物与DNA序列数量、属性等信息的文件,给项目团队进行进一步分析。

对于每一个DEL筛选,我们需要遍历有丰富的信号数百个甚至上千个3维Data Warrior文件。为了提高数据处理的速度,及时做出数据驱动的决策,我们构建了DELT数据分析自动化平台,实现了数据的自动处理和报告。这个自动化系统能够在DNA测序完成后,自动启动,并能在大约一天内完成筛选结果的自动报告,共化学家进行进一步确认和选定化合物进行重合成。

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  • 苗头化合物推荐(Hit Proposal)与合成

在Hit Proposal过程中,我们一般有以下几点考虑:1)信号强度(序列计数、富集特征强度)、化学型多样性、化合物物化性质、不同DNA编码化合物库间的结构关联和作用机制(样本间信号比较)。具有代表性的Hit Proposal工作流程如下图所示。

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成都先导拥有经验丰富的化学团队,他们参与过数百个项目的重合成,熟悉DNA编码化合物合成的反应、具有在库的试剂、拥有先进的设备和仪器,能够在合成行业中发挥最佳的效能。通常,每种化合物5毫克,最多100种化合物,合成周期约为6周。我们针对活性化合物、化合物骨架等提供克级合成。 


  • 生物物理、生物化学检测用于化合物的验证


  • ASMS(亲和筛选质谱分析)进行化合物富集验证

由于DEL化合物库的反应有可能没有100%完成,而且DEL筛选极为灵敏,所以我们采用亲和筛选质谱分析(ASMS)对富集的带有DNA的化合物进行验证,以进一步确证筛选中获得的可能结合物,提高化合物的筛选后转化率。这种方法通过模拟DEL合成过程,同时考虑了产物和副产物。我们也在探索不同类型的可切割连接体,它们在DEL合成过程中保持相同的条件,同时也避免了亲和力选择过程中DNA标签的影响。


  • DEL筛选结果(SSR分析)驱动的化合物优化

海量的DEL筛选信息是进一步探测目标口袋、提供复合优化方向的重要资源。结构-信号关系(SSR)分析是在同一化合物族的基础上进行的,这意味着化合物所涉及的化学成分高度相似,序列计数阳性与生物活性相关,将为优化中的结构优化方向和实际选择提供大量和快捷的信息。代表性结构-信号关系分析如下所示,从中可以看出其在进一步优化中的指向性。


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结构-信号关系分析流程图

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