DNA编码化合物库应用

通过DNA编码化合物库筛选发现新颖高活性NAA50抑制剂

 (与美国辉瑞合作项目，细节请参考 ACS Med. Chem. Lett. 2020, 11, 1175−1184)

• NAA50蛋白与功能

蛋白质的N末端乙酰化可以影响其是否进入细胞核，也可以作为降解信号来控制蛋白质的细胞稳定性。Nα-末端乙酰转移酶（NAA50）是Nα-末端乙酰转移酶NAT蛋白家族的成员。

它与NAA10和NAA15共存于NatE复合物中，并负责复合物的酶功能。NAA50也被发现是正常姐妹染色单体凝聚和染色体凝聚所必需的。因此，NAA50酶抑制剂可能在肿瘤适应症中有治疗应用。酶催化和蛋白质结构如下所示。

• 已知NAA50异质结和DNA编码化合物库筛选目标

化合物1是通过研究NAA50的生化机制设计的，它是AcCoA因子、一个蛋白的四肽底物（MLGP）的复合物。尽管化合物1是一种有效的NAA50抑制剂，但由于其分子量大（配体效率（LE）= 0.13），该分子不是特别有效。此外，其高分子量（MW=1223）和高极性（tPSA=577和cLogP=−4.1）可能阻止细胞膜的易渗透性，因此仅能作为一种好的外工具化合物使用。

DNA编码化合物库筛选是为了获得活性更高、选择性更好的NAA50抑制剂，并且具有更好的理化性质（降低分子量、tPSA，增加logD）。

• DNA编码化合物库筛选实验设计

在典型的DEL选择方案中，我们设置了3个样本（靶标本身，本案例为His标签的NAA50蛋白；His标签的NAA50蛋白加上饱和浓度下的抑制剂化合物1；空白对照）。然而，在NAA50的研究中，我们发现NAA50蛋白在催化过程中涉及构象的变化。通过上述样品1和样品2的选择结果的比较，我们不能有效地识别抑制剂。因此，我们通过添加AcCoA和CoA来加入另外两个样品，寻找与过渡态结合的化合物。最后的筛选实验设计如下:

• 代表性的筛选结果

DNA编码化合物库筛选的结果通常以3维形式展示，其中每个轴表示相应的反应砌块，气泡大小表示每个化合物的DNA序列的数量。如果化合物与蛋白质有更多的结合（高亲和力或慢解离速率），序列数量将呈现为更大的气泡。从前四个样品（空白样品5最为扣减样本，未显示）可以看出，Apo-NAA50、Apo-NAA50+AcCoA、Apo-NAA50+CoA和Apo-NAA50+化合物1（也称为Bi-subi）的富集模式不同，证明NAA50在催化过程中有构象变化。选择与所有蛋白质阶段结合并与化合物1竞争的化合物显然将产生NAA50抑制剂。在本案例中，其中一个选定的化合物结构如下图所示（DNA编码化合物库中为外消旋体混合物）。所选化合物DEL951-34-888-1668进行了重合成与验证。 

• 化合物验证与化合物-蛋白共晶 

我们对所选化合物DEL951-34-888-1668的两个异构体进行合成（4a和4b），并在CoA和AcCoA存在下进行了SPR亲和力测定和生化分析。手性异构体4a被发现是一种非常有效的抑制剂，具有更低的分子量、配体效率（LE）和tPSA。辉瑞对该化合物进行蛋白-化合物共结晶，下图为化合物4a和NAA50的共晶结构（pdb代码：6WFN）。

DNA编码化合物库技术实现新颖BRD4蛋白降解剂的发现

• DNA编码化合物库技术在蛋白降解剂发现上的优势

DNA编码化合物库实现是一种基于亲和力的方法来识别与靶相互作用的化合物，这些化合物可能具有抑制或激动的功能或仅仅与蛋白质结合。DNA编码化合物的结构与蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）非常相似，如下图所示。DEL化合物和PROTAC分子都需要两个具有已知连接点的分子共价连接，这两个连接点对结合的影响最小。 

更重要的是，DNA编码化合物库筛选能够识别感兴趣的蛋白质（POI）和E3连接酶的亲和力结合物，因此通过它们的组织分布差异，在创造更强的知识产权和探索新型E3连接酶的治疗效益方面具有优势。 

在传统的DNA编码化合物库筛选当中，目标是寻找化合物，筛选的直接读数是DNA序列的绝对数（理想情况下是化合物的绝对数量）。原则上，当POI和E3连接酶都用在DNA编码化合物筛选时，我们可以使用POI和/或E3连接酶作为对照来鉴定与这两种蛋白质同时结合的化合物。

• POI-化合物-E3连接酶复合体稳定性是蛋白降解剂优化的关键

为了验证上述理论，我们以JQ1为BRD4亲和化合物，沙利度胺为CRBN结合化合物，用不同长度的连接体来测试是否能够区分三元键合的稳定性。具体地，我们合成了六个PROTAC分子和dBET1（一个著名的BRD4降解剂，Biochem Biophys Res common。2018，497（1）：410-415），并测量其IC50值（下图）。从IC50值上，我们无法知道哪一个结合BRD4和CRBN形成更稳定的复合物。 

然后用基于FRET的三元复合物稳定性实验对这6个PROTAC分子和dBET1进行了评价，它们在三元复合体稳定性实验中表现不同。BRD4在MV4；11中的降解实验也证实了这6个PROTAC分子的降解差异（见下图）。

• DNA编码化合物筛选信号与三元复合物稳定性正相关

为了证实DEL筛选能够区分复合物的稳定性，我们制备了6个相应的PROTAC-DNA共轭化合物（如图），以观察DEL筛选是否可以观察到不同的回收率。在“共轭化合物回收实验”中，将共轭化合物1~6汇集到我们的DNA编码化合物库中，进行DEL筛选，并比较相应的DNA序列计数，如图所示（DEL筛选请参考“PROTAC DEL筛选方法”）。共轭化合物-4是公认的最佳降解分子，因为它有显着更高的测序计数，这是对应的数量化合物结合到CRBN-BRD4复合物。该链接链的长度与dBET1中的最佳链接器长度一致。另外，从仅针对于CRBN和BRD4筛选的样本中共轭化合物的回收实验并不能预示哪个链长的共轭化合物具有最佳的链长。

PROTAC-DNA 共轭化合物

DNA编码化合物库筛选中共轭化合物的回收（CRBN，BRD4，CRBN+BRD4）

• 通过DNA编码蛋白降解化合物库进行新颖BRD4蛋白降解剂的发现

我们的DNA编码蛋白降解化合物库包括E3连接酶结合化合物和数量巨大的多样性化合物结构以及不同长度的链长。下图是PROTAC DEL的通式，其中沙利度胺靶向结合CRBN，R1、R2、R3分别是化合物库的链和不同化合物的砌块。

以CRBN为E3连接酶的DNA编码蛋白降解库结构

• 蛋白降解库的筛选和项目目标

在这个DNA编码的蛋白降解化合物库中，沙利度胺为公认的CRBN结合化合物，在本案中针对CRBN的筛选样本被忽略。具体实验方案如下：

本项目的目的是获得与BRD4和CRBN结合的新化合物，然后证明样品2中具有强信号的PROTAC分子能更好地降解BRD4。

• DNA编码蛋白降解化合物库筛选结果

下图中的样品1和样品2（未显示空白样品）之间比较了DEL化合物富集的选定R3的化合物。

                                                                样本1                                                 样本2 

平面R3=348清楚地表明，这个平面上的许多化合物优先与两种蛋白质结合（样品2），而不仅仅是BRD4（样品1）。同时，也有许多化合物与两种样品的结合强度相似。需要说明的是，所有用于BRD4结合的化合物结构都不同于JQ1或任何报道的BRD4结合物。为了比较二者的结构相似性，用Tarnimoto相似性来描述二者之间的差异。当Tarnimoto相似性大于0.8时，两个分子被认为是相似的。选择具有代表性的化合物，其tarnimoto相似性分数如图，说明我们发现的化合物为全新结构。

根据我们的推测，在样本2中气泡较大（测序计数较高）的化合物比气泡较小的化合物形成更稳定的复合物。为了证明这一点，我们在样品2中选择了4个具有不同序列计数（DNA序列计数为1198，15042，119，4459）的代表性化合物，用于非DNA合成和蛋白质降解评价（western blot）。这4种化合物分别命名为75-NX-1、78-NX-1、123-NX-1和127-NX-1。以dBET1为参照物，测序计数较高的化合物75-NX-1、78-NX-1在MV4；11细胞中观察到非常相似的BRD4降解；而化合物123-NX-1几乎没有观察到BRD4降解。化合物127-NX-1也没有显示BRD4降解。

在MV4；11（CCK-8）的抗增殖试验中，对PROTAC化合物75-NX-1及其BRD4结合部分（57-NX-1，未显示结构）进行了评价，结果表明，化合物75-NX-1的活性远高于57-NX-1（化合物57-NX-1被发现是BRD4抑制剂）。

MV4;11细胞抗增殖实验

综上所述，通过DNA编码蛋白降解剂库筛选是一种快速和有效发现稳定POI：化合物：E3连接酶复合物的方法。我们充分意识到，还有其他因素可能影响蛋白质降解，如蛋白降解剂的溶解度、透膜性、结合方式等，但毫无疑问，DEL筛选方法为三元复合物的形成（蛋白质降解剂优化的一个重要步骤）提供了非常有效的工具。